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化妝品微生物標準檢驗方法金黃色葡萄球菌及注解


錄入時間:2006-6-27 8:27:04 來源:其它

   
   化妝品微生物標準檢驗方法金黃色葡萄球菌及注解
中華人民共和國國家標準
化妝品微生物標準檢驗方法金黃色葡萄球菌 UDC 668:576 .85.07
(GB7918.5-87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics
Staphylococcus aureus
金黃色葡萄球菌在外界分布較廣,抵抗力也較強能引起人體局部化膿性病灶,嚴重時可導致敗血癥,因此化妝品中檢驗金黃色葡萄球菌有重要意義。
1 方法提要
根據本菌特有的形態及培養物質性,應用Baird Parker平板進行分離,該平板中的氯化鋰可抑制革蘭氏陰性細菌生長,丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長,以提高檢出率,并利用分解甘露醇和血漿凝固酶等特征,以茲鑒別。
2 培養基和試劑
2.1 培養基
2.1.1 SCDLP液體培養基
見GB 7918.1 - 87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。
2.1.2 7.5%的氯化鈉肉湯
成分:蛋白胨          10g
牛肉膏                 3g
氯化鈉                 75g
蒸餾水               1000ml
制法:將上述成分加熱溶解,調pH為7.4,分裝,121℃(15 1b)15min高壓滅菌。
2.1.3 Baerd Parker 平板
成分: 胰蛋白胨           10g
牛肉膏                     5g
酵母浸膏                   1g
丙酮酸鈉                  10g
甘氨酸                    12g
氯化鋰(LiCl·6H2O)          5g
瓊脂                      20g
蒸餾水                  950ml
                       pH7.0±0.2
增菌劑的配制:30%卵黃鹽水50ml與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10ml&127;混合,保存于冰箱內。
制法:將各成分到蒸餾水中,加熱煮沸完全溶解,冷至25℃校正pH。分裝每瓶95ml,121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂,每95ml加入預熱到50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5ml,搖勻后傾注平板。培養基應是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過48h。
2.1.4 血瓊脂培養基
成分:營養瓊脂                   100ml
脫纖維羊血(或兔血)                10ml
制法:將營養瓊脂加熱溶化,待冷至50℃左右以無菌手續加入脫纖維羊血,搖勻,制成平板,置冰箱內備用。
2.1.5 甘露醇發酵培養基
成分: 蛋白胨                   10g
氯化鈉                           5g
甘露醇                          10g
牛肉膏                           5g
0.2%溴麝香草酚藍溶液         12ml
蒸餾水                       1000ml
制法: 將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中,加熱溶解,調pH7.4,加入甘露醇和指示劑,混勻后分裝試管中,115℃(10 1b)20min滅菌備用。
2.1.6 兔(人)血漿制備
取3.8%檸檬酸鈉溶液〔121℃(15 1b)30min滅菌〕1份加兔(人)全血4份,混勻靜置,2000~3000r/min離心3~5min。血球下沉,取上面血漿。
3 設備和材料
3.1 顯微鏡。
3.2 培養箱。
3.3 離心要。
3.4 滅菌吸管:1ml,5ml,10ml。
3.5 滅菌試管。
3.6 載玻片。
3.7 酒精燈。
4 操作步驟
4.1 增菌:取1:10稀釋的樣品10ml接種到90mlSCDLP液體培養基中(如無此培養基也可用7.5%氯化鈉肉湯),置37℃培養箱, 培養24h。(1)
注:如無此培養基也可用7.5%氯化鈉肉湯,檢驗含防腐劑的化妝品時,可在 1000ml此培養基中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
4.2 分離:自上述增菌培養液中,取1~2接種環,劃線接種在Baird Parker氏培養基,如無此培養基也可劃線接種到血瓊脂平板,置37℃培養24~48。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色,大而突起,圓形,不透明,表面光滑,周圍有溶血圈。在Baird Parker 氏培養基上為圓形,光滑,凸起,濕潤,直徑為2~3mm,顏色呈灰色到黑色,邊緣為淡色,周圍為一混濁帶,在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落,但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上,置37℃培養24H。
4.3 染色鏡檢:挑取分純菌落,涂片,進行革蘭氏染色,鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,排列成葡萄狀,無芽胞,無夾膜,致病性葡萄球菌,菌體較小,直徑約為0.5~1μm。
4.4 甘露醇發酵試驗:取述分純菌落接種到甘露醇發酵培養基中,置37℃培養24h,金黃色葡萄球菌應能發酵甘露醇產酸。
4.5 血漿凝固酶試驗
4.5.1 玻片法:取清潔干燥載玻片,一端滴加一滴滅菌生理鹽水,另一端滴加一滴血漿,用接種環挑取待檢菌落,分別在生理鹽水及血漿中充分研磨混合。血漿與菌苔混懸液在5min內出現團塊或顆粒狀凝塊時,而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固現象者為陽性,如兩者均無凝固現象則為陰性。凡玻片試驗呈陰性反應或鹽水滴與血漿滴均有凝固現象,再進行試管凝固酶試驗。
4.5.2 試管法:吸取1:4新鮮血漿0.5ml,放入滅菌小試管中,再加入待檢菌24h肉湯培養物0.5ml。混勻,放37℃溫箱或水浴中,每半小時觀察一次,24h之內如呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養物及肉湯培養基各0.5ml 1:4血漿混勻,做為對照。
5 檢驗結果報告
凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長,經染色鏡檢,證明為革蘭氏陽性葡萄球菌,并能發酵甘露醇產酸。血漿凝固酶試驗陽性者,可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。
附加說明:
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所歸口。
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。
本標準主要起草人劉以賢。
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所負責解釋
注解:
(1)增菌培養
本標準方法用SCDLP增菌液增菌,其成分中含有中和劑,抑菌效果較差,雜菌生長較多。在增菌培養基中加適量的亞碲酸鉀(鈉),當金黃色葡萄球菌生長時可將其還原,變為黑色,使培養液增加堿性;亞碲酸鉀(鈉)并可與蛋白胨中含硫氨基酸結合,形成的亞碲酸與硫的復合物,有抗細菌硫源代謝作用,因而可抑制其他細菌生長繁殖。
(2)分離培養
分離金黃色葡萄球菌的培養基有(Vogel-Johnson瓊脂、Baird Parker瓊脂、血瓊脂、卵黃高鹽瓊脂、TMP瓊脂等、CTFA、FDA和日本的方法均用Vogel-Johson瓊脂培養基。我國食品微生物標準檢驗方法規定Baird Parker瓊脂和血瓊脂培養基。Vogel-Johnson瓊脂和Baird-Parker瓊脂的基本成分類似。為尊重傳統習慣用法,在化妝品標準檢驗方法中只選用Baird-Parker和血瓊脂二種培養基。現將各分離鑒別培養基的主要成分,作用機制和注意事項介紹如下:
1) Baird-Parker和Vogel-Johnson瓊脂培養基中的氯化鉀可抑制革蘭氏陰性菌生長,丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長,以提高檢出率。
2)血瓊脂不僅適應金黃色葡萄球菌的生長,菌落較大,顏色鮮明,而且有鑒別溶血反應的作用,可作為血凝固酶試驗的補充,增加致病菌株的檢出機會。
3)卵黃高鹽瓊脂、氯化鈉用量較大,滲透壓高,有抑制某些細菌的生長作用。卵黃中的卵磷脂,有促進金黃色葡萄球菌的生長發育和鑒別的作用。該菌的卵磷脂酶可分解卵磷脂,因而生長的典型菌落,表面周圍有月暈狀油膜,底部有乳濁圈,易于鑒別,本培養基抑菌作用較小,雜菌生長較多。
表4金葡萄球菌的菌落特征
培養基
 菌落特征
 
Baird-Parker瓊脂
 圓形隆起,光滑,直徑為2~3mm,呈灰色到黑色,邊緣色淡,周圍為一混濁帶,外層有一透明帶。
 
血瓊脂
 金黃色,圓形隆起,邊緣整齊,外周有透明的深血環,直徑為1~2mm。
 
卵黃高鹽
 金黃色,圓形隆起,邊緣整齊,直徑為1~2mm,外周有卵磷脂被分解的乳濁圈。
 
TMP瓊脂
 金黃色,圓形隆起,邊緣整齊,直徑0.7~1mm,周圍有黃色環。
 
4)TMP瓊脂:加有適量亞碲酸鉀,多量氯化鈉以及甘露醇和酚紅指示劑,抑制雜菌的作用較強,應適當加大接種量,取3~5環增菌液劃線。金黃色葡萄球菌可還原亞碲酸鉀使之變黑,并可發酵甘露醇產酸,使指示劑變黃,以致菌落呈墨黑色,周圍有黃色環,容易鑒別。亞碲酸鉀的用量應注意準確,因其抑菌力較強,對金黃色葡萄球菌的生長也有一定影響,因而菌落較小。
(3)糖發酵試驗:多數葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、產酸不產氣,致病性葡萄球菌在厭氧條件下分解甘露醇、產酸,非致病性葡萄球菌無此作用。
(4)血漿凝固酶試驗
試管法是檢測葡萄球菌的胞外游離血漿凝固酶(作用于凝固酶原)。
玻片法是檢測結合血漿凝固酶(作用于纖維蛋白原)。此法快速、簡便,大多數中間型葡萄球菌和豬葡萄球菌呈陰性反應。金黃色葡萄球菌中有10~15%可呈陰性反應。
有學者推薦乳膠凝集試驗作為快速及常規檢驗方法。將1:8稀釋的乳膠、懸液與等量人血漿(用EDTA處理后,經甘氨酸。鹽酸緩沖液作1:1000稀釋)混合制成乳膠制劑。試驗時將待檢菌置于加鹽水的玻片上,再加一滴乳膠試劑,混勻觀察結果,凝集則為血漿凝固酶陽性。本法的準確如同試管法。
(5)檢驗報告
1)按常規程序檢驗,凡分離出革蘭氏陽性葡萄球菌的疑似菌落,經證實可發酵甘露醇、血漿凝固酶陽性的菌株,可報告檢出金黃色葡萄球菌。
2)如果分離的疑似菌落不發酵甘露醇,但血漿凝固酶陽性也可斷定為檢出金黃色萄葡球菌。
3)分離出的葡萄球菌疑似菌落,不發酵甘露醇、血漿凝固醇陰性,判斷未檢出金黃色葡萄球菌。

 

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