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沙門氏菌檢驗


錄入時間:2006-6-26 16:34:11 來源:其它

   
   1 主題內容與適用范圍
  本標準規定了食品中沙門氏菌的檢驗方法。
  本標準適用于食品和食物中毒樣品中沙門氏菌的檢驗。
  2 引用標準
  GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗 染色法、培養基和試劑
  3 設備和材料
  3.1 天平:稱取檢樣用。
  3.2 均質器或乳缽。
  3.3 溫箱:36±1℃,42℃。
  3.4 顯微鏡。
  3.5 滅菌廣口瓶:500mL。
  3.6 滅菌三角燒瓶:500mL,250mL。
  3.7 滅菌吸管:10mL。
  3.8 天菌平皿:90mm×15mm。
  3.9 滅菌小試管:內徑3mm,長5cm。
  3.10 滅菌毛細管。
  3.11 橡皮乳頭。  
  3.12 載玻片。
  3.13 酒精燈。  
  3.14 滅菌金屬匙或玻璃棒。
  3.15 接種棒、鎳鉻絲。
  3.16 試管架、試管簍。
  4 培養基和試劑
  4.1 緩沖蛋白胨水(BP):按GB 4789.28中4.12規定。
  4.2 氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液:按GB 4789.28中4.13規定。
  4.3 四硫酸鈉煌綠(TTB)增菌液:按GB 4789.28中4.14、4.15規定。
  4.4 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:按GB 4789.28中4.16規定。
  4.5 亞硫酸鉍瓊脂(BS):按GB 4789.28中4.19規定。
  4.6 DHL瓊脂:按GB 4789.28中4.20規定。
  4.7 HE瓊脂:按GB 4789.28中4.21規定。
  4.8 WS瓊脂:按GB 4789.28中4.23規定。
  4.9 SS瓊脂:按GB 4789.28中4.22規定。
  4.10 三糖鐵瓊脂:按GB 4789.28中4.26,4.27規定。
  4.11 蛋白胨水、靛基質試劑:按GB 4789.28中3.13規定。
  4.12 尿素瓊脂(pH7.2):按GB 4789.28中3.15規定。
  4.13 氰化鉀(KCN)培養基:按GB 4789.28中3.16規定。
  4.14 氨基酸脫羧酶試驗培養基:按GB 4789.28中3.12規定。
  4.15 糖發酵管:按GB 4789.28中3.2規定。
  4.16 ONPG培養基:按GB 4789.28中3.3規定。
  4.17 半固體瓊脂:按GB 4789.28中4.30規定。
  4.18 丙二酸鈉培養基:按GB 4789.28中3.7規定。
  4.19 沙門氏菌因子血清:按26種用于初步分型;57種用于進一步分型;163種用于詳細分型。
  5 檢驗程序
  沙門氏菌檢驗程序如下:
  (圖略)
  6 操作步驟
  6.1 前增菌和增菌
  凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應經過前增菌。各稱取檢樣25g,加在裝有225mL緩沖蛋白陳水的500mL廣口瓶內。固體食品可先應用均質器以8000~10000r/min打碎1min,或用乳缽加滅菌砂磨碎,粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化,于36±1℃培養4h(干蛋品培養18~24h),移取10mL,轉種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內,于42℃培養18~24h。同時,另取10mL,轉種于100mL亞硒酸鹽骯氨酸增菌液內,于36±1℃培養18~24h。
  鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經加工的食品不必經過前增菌。各取25g(25mL)加入滅菌生理鹽水25mL,按前法做成檢樣勻液;取25mL,接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內,于42℃培養24h;另取25mL接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內,于36±1℃培養18~24h。
  6.2 分離
  取增菌液1環,劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板和一個DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板)。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于36±1℃分別培養18~24h(DHL、HE、WS、SS)或40~48h(BS),觀察各個平板上生長的菌落,沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙門氏菌Ⅲ在各個平板上的菌落特征見表1。
  表1 沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征
  (圖略)
  6.3 生化試驗
  6.3.1 自選擇性瓊脂平板上直接挑取數個可疑菌落,分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂內,腸桿菌科常見屬種的反應結果見表2。
  表2 腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果
  (圖略)
  續表2
  (圖略)
  表2說明在三糖鐵瓊脂內只有斜面產酸并同時硫化氫(H2S)陰性的菌株可以排除,其他的反應結果均有沙門氏菌的可能,同時也均有不是沙門氏菌的可能。
  6.3.2 在接種三糖鐵瓊脂的同時,再接種蛋白陳水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養基和賴氨酸脫竣酶試驗培養基及對照培養基各1管,于36±1℃培養18~24h,必要時可延長至48h,按表3判定結果。按反應序號分類,沙門氏菌屬的結果應屬于A1、A2和B1,其他5種反應結果均可以排除。
  表3 腸桿菌科各屬生化反應初步鑒別表
  (圖略)
  6.3.2.1 反應序號A1:典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸3項中有1項異常,按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常,則按A3判定為弗勞地氏檸檬酸桿菌。
  表4
  (圖略)
  注:+表示陽性;-表示陰性。
  6.3.2.2 反應序號A2:補做甘露醇和山梨醇試驗,按表5判定結果。
  表5
  (圖略)
  6.3.2.3 反應序號B1:補做ONPG。ONPG十為大腸埃希氏菌,ONPG-為沙門氏菌。同時,沙門氏菌應為賴氨酸+,但甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸-。
  6.3.2.4 必要時按表6進行沙門氏菌生化群的鑒別。
  表6 沙門氏菌屬各生化群的鑒別
  (圖略)
  6.4 血清學分型鑒定
  6.4.1 抗原的準備
  一般采用1.5%瓊脂斜面培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。
  O血清不凝集時,將菌株接種在瓊脂量較高的(如2.5%一3%)培養基上再檢查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應時,可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液,于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發育不良時,將菌株接種在0.7%~0.8%半固體瓊脂平板的中央,候菌落蔓延生長時,在其邊緣部分取菌檢查;或將菌株通過裝有0.3%~0.4%半固體瓊脂的小玻管1~2次,自遠端取菌培養后再檢查。
  6.4.2 O抗原的鑒定
  用A~F多價O血清做玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株,不能分型。
  被A~F多價O血清凝集者,依次用O4;O3、10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集試驗。根據試驗結果,判定O群。被O3、10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集試驗,判定E1、E2、E3、E4各亞群,每一個O抗原成分的最后確定均應根據O單因子血?宓募觳榻峁揮蠴單因子血清的要用兩個O復合因子血清進行核對。
  不被A~F多價O血清凝集者,先用57種或163種沙門氏菌因子血清中的9種多價O血清檢查,如有其中一種血清凝集,則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查,以確定O群。每種多價O血清所包括的O因子如下:
  O 多價 1  A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)
  O 多價 2  13,16,17,18,21群
  O 多價 3  28,30,35,38,39群
  O 多價 4 40,41,42,43群
  O 多價 5 44,45,47,48群
  O 多價 6 50,51,52,53群
  O 多價 7 55,56,57,58群
  O 多價 8 59,60,61,62群
  O 多價 9 63,65,66,67群
  6.4.3 H抗原的鑒定
  屬于A~F各O群的常見菌型,依次用表7所述H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。
  表7 A~F群常見菌型H抗原表
  (圖略)
  不常見的菌型,先用163種沙門氏菌因子血清中的8種多價H血清檢查,如有其中一種或兩種血清凝集,則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查,以確定第1相和第2相的H抗原。8種多價H血清所包括的H因子如下:
  H 多價 1 a,b,c,d,i
  H 多價 2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
  H 多價 3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
  H 多價 4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
  H 多價 5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
  H 多價 6 z39,z41,z42,z44
  H 多價 7 z52,z53,z54,z55
  H 多價 8 z56,z57,z60,z61,z62
  每一個H抗原成分的最后確定均應根據H單因子血清的檢查結果,沒有H單因子血清的要用兩個H復合因子血清進行核對。
  檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的,可在瓊脂斜面上移種1~2代后再檢查。如仍只檢出一個相的H抗原,要用位相變異的方法檢查其另一個相。單相菌不必做位相變異檢查。
  位相變異試驗方法如下:
  小玻管法:將半固體管(每管約1~2mL)在酒精燈上溶化并冷至50℃,取已知相的H因子血清0.05一0.1mL,加入于溶化的半固體內,混勻后,用毛細吸管吸取分裝于供位相變異試驗的小玻管內,候凝固后,用接種針挑取待檢菌,接種于一端。將小玻管平放在平皿內,并在其旁放一團濕棉花,以防瓊脂中水分蒸發而干縮,每天檢查結果,待另一相細菌解離后,可以從另一端挑取細菌進行檢查。培養基內血清的濃度應有適當的比例,過高時細菌不能生長,過低時同一相細菌的動力不能抑制。一般按原血清1∶200~1∶800的量加入。
  小倒管法:將兩端開口的小玻管(下端開口要留一個缺口,不要平齊)放在半固體管內,小玻管的上端應高出于培養基的表面,滅菌后備用。臨用時在酒精燈上加熱溶化,冷至50℃,挑取因子血清1環,加入小套管中中的半固體內,略加攪動,使其混勻,俟凝固后,將待檢菌株接種于小套管中的半固體表層內,每天檢查結果,待另一相細菌解離后,可從套管外的半固體表面取菌檢查,或轉種1%軟瓊脂斜面,于37℃培養后再做凝集試驗。
  簡易平板法:將0.7%~0.8%半固體瓊脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1環,滴在半固體平板表面,放置片刻,待血清吸收到瓊脂內,在血清部位的中央點種待檢菌株,培養后,在形成蔓延生長的菌苔邊緣取菌檢查。
  6.4.4 Vi抗原的鑒定
  用Vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有:傷寒沙門氏菌,丙型副傷寒沙門氏菌,都柏林沙門氏菌。
  6.5 菌型的判定和結果報告
  綜合以上生化試驗和血清學分型鑒定的結果,按照表8或有關沙門氏菌屬抗原表判定菌型,并報告結果。
  表8 常見沙門氏菌抗原表
  (圖略)
    附加說明:
  本標準由衛生部衛生監督司提出。
  本標準由江西省衛生防疫站負責起草。
  本標準主要起草人何曉青。
  本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。

 

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